Video: Tre metoder til division 2024
En vigtig del af bioteknologisk forskning er at anvende proteinteknik til at designe eller modificere proteiner med optimerede egenskaber til specifikke industrielle anvendelser. For at gøre dette skal forskeren være i stand til at isolere og rense proteiner af interesse, så deres konformationer, substratspecificiteter, reaktioner med andre ligander og specifikke aktiviteter kan undersøges.
Graden af proteinrenhed, der kræves, afhænger af den tilsigtede endelige anvendelse af proteinet.
For nogle anvendelser er et råekstrakt tilstrækkeligt. For andre anvendelser, som f.eks. I fødevarer og farmaceutiske produkter, kræves der et højt renhedsniveau. For at opnå dette anvendes flere proteinrensningsfremgangsmåder typisk i en række oprensningstrin.
Hvert proteinrensningstrin resulterer normalt i en vis grad af produkttab. Derfor er en ideel proteinrensningsstrategi en, hvor det højeste niveau af rensning nås i de færreste trin. Udvælgelsen af hvilke trin der skal anvendes afhænger af målproteins størrelse, ladning, opløselighed og andre egenskaber. De følgende teknikker er mest egnede til oprensning af et enkelt cytosolisk protein. Oprensning af cytosoliske proteinkomplekser er mere kompliceret og kræver normalt, at forskellige metoder anvendes.
Det første trin i rensning afintracellulære
(inde i cellen) proteiner er fremstillingen af en rå ekstrakt . Ekstrakten vil indeholde en kompleks blanding af alle proteinerne fra cellecytoplasma og nogle yderligere makromolekyler, cofaktorer og næringsstoffer. Råekstrakt kan anvendes til nogle anvendelser inden for bioteknologi, men hvis renhed er et problem, skal efterfølgende rensningstrin følges. Råproteinekstrakter fremstilles ved fjernelse af cellulære affald frembragt ved cellelys, hvilket opnås ved anvendelse af kemikalier og enzymer, sonikering eller fransk presse.
Affaldet fjernes ved centrifugering, og supernatanten udvindes. Rå præparater af ekstracellulære proteiner kan opnås ved simpelthen at fjerne cellerne ved centrifugering.
For visse bioteknologiske anvendelser er der en efterspørgsel eftertermostabile enzymer
: Enzymer, der kan tolerere høje temperaturer uden denaturering, og samtidig opretholde en høj specifik aktivitet. Organer der producerer dem kaldes undertiden ekstremofiler. En nem tilgang til rensning af et varmebestandigt protein er at denaturere de andre proteiner i blandingen ved opvarmning og derefter afkøle opløsningen (således at det termostabile enzym kan reformere eller genopløses om nødvendigt. De denaturerede proteiner kan derefter fjernes ved centrifugering. Intermediate Purification Steps Tidligere var et fælles andet trin til oprensning af et protein fra et råekstrakt ved
udfældning
i en opløsning med høj osmotisk styrke (dvs.e. saltopløsninger). Nukleinsyrer i råekstraktet kan fjernes ved udfældning af aggregater dannet med streptomycinsulfat eller protaminsulfat. Proteinudfældning udføres sædvanligvis under anvendelse af ammoniumsulfat som saltet. Forskellige proteiner vil falde ud i forskellige koncentrationer af ammoniumsulfat
. Proteiner med højere molekylvægt bundfald i lavere koncentrationer af ammoniumsulfat. Saltudfældning fører normalt ikke til et højt oprenset protein, men kan medvirke til at eliminere nogle uønskede proteiner i en blanding og koncentrere prøven. Salte i opløsningen fjernes derefter ved dialyse gennem porøs celluloseslang, filtrering eller geleksklusionskromatografi. Moderne bioteknologiske protokoller udnytter ofte de mange kommercielt tilgængelige kits, som giver klare løsninger til standardprocedurer. Proteinrensning udføres ofte ved anvendelse af filtre og fremstillede gelfiltreringskolonner. Alt du skal gøre er at følge instruktionerne og tilføj det rigtige volumen af den rigtige løsning og vente den angivne tid, mens du samler eluenten (hvad der kommer ud i den anden ende af kolonnen) i et nyt reagensglas.
Kromatografiske metoder kan påføres ved hjælp af bench-top kolonner eller automatiseret HPLC udstyr. Separation ved HPLC kan udføres ved omvendt fase, ionbytter eller størrelsesekskluderingsmetoder og prøver detekteret af diode array eller laserteknologi.
Proteinvisualisering og vurdering af oprensning
- Omvendtfase-kromatografi
(RPC) adskiller proteiner baseret på deres relative
- hydrofobiciteter . Denne teknik er meget selektiv, men kræver brug af organiske opløsningsmidler. Nogle proteiner er permanent denatureret af opløsningsmidler og vil miste funktionalitet under RPC. Derfor anbefales denne metode ikke til alle anvendelser, især hvis det er nødvendigt for målproteinet at bevare aktiviteten. Ionbytningskromatografi henviser til adskillelsen af proteiner baseret på
- ladning . Kolonner kan enten fremstilles til anionbytter eller kationbytter. Anionbytter søjler indeholder en stationær fase med en positiv ladning, der tiltrækker negativt ladede proteiner. Kationbytter kolonner er de omvendte, negativt ladede perler, der tiltrækker positivt ladede proteiner. Eluering af målproteinet (proteinerne) udføres ved at ændre pH i søjlen, hvilket resulterer i en ændring eller neutralisering af de ladede funktionelle grupper af hvert protein. Størrelseseksklusionskromatografi ( gelfiltrering
- ) adskiller større proteiner fra små, da de større molekyler rejser hurtigere gennem den tværbundne polymer i kromatografikolonnen. De store proteiner passer ikke ind i porerne i polymeren, mens mindre proteiner gør, og tager længere tid at rejse gennem kromatografikolonnen via deres mindre direkte vej. Eluat opsamles i en række rør, der adskiller proteiner baseret på elueringstid. Gelfiltrering er et nyttigt værktøj til koncentrering af en proteinprøve, eftersom målproteinet opsamles i et mindre elueringsvolumen end i begyndelsen tilsat til søjlen.Lignende filtreringsteknikker kan anvendes under storskalet proteinproduktion på grund af deres omkostningseffektivitet. Affinitetskromatografi er en meget nyttig teknik til "polering" eller komplettering af proteinrensningsfremgangsmåden. Perler i kromatografikolonnen er tværbundet til ligander, der binder specifikt til målproteinet. Proteinet fjernes derefter fra søjlen ved skylning med en opløsning indeholdende frie ligander. Denne metode giver de reneste resultater og højeste specifikke aktivitet i forhold til andre teknikker.
- SDS-PAGE er polyacrylamidgelelektroforese, udført i nærværelse af SDS (natriumdodecylsulfat), som binder til proteiner, der giver dem en stor netto negativ ladning. Da afgifterne for alle proteiner er ret lige, adskiller denne metode dem næsten helt ud fra størrelsen. SDS-PAGE bruges ofte til at teste renheden af protein efter hvert trin i en serie. Da uønskede proteiner gradvist fjernes fra blandingen, reduceres antallet af bånd, der visualiseres på SDS-PAGE-gelen, indtil der kun er et bånd, der repræsenterer det ønskede protein.
- Immunoblotting er en proteinvisualiseringsteknik anvendt i kombination med affinitetskromatografi. Antistoffer til et specifikt protein anvendes som ligander på en affinitetskromatografikolonne. Målproteinet bibeholdes på søjlen og fjernes derefter ved skylning af søjlen med en saltopløsning eller andre midler. Antistoffer forbundet med radioaktive eller farvestofmærker hjælper til påvisning af målproteinet, når det er adskilt fra resten af blandingen.
- Kilder: Zubay G. 1988. Biokemi, 2. udgave. Macmillan Publishing Co., New York, NY, USA.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Proteinrensningshåndbog, udgave AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc., New Jersey, USA. // www. Biochem. uiowa. edu / Donelson / Database% 20items / protein_purification_handbook. pdf.
Metoder til at spore din marketingkampagne
Tracking er afgørende for succesen med enhver marketingkampagne. Lær hvordan du sporer og overvåger din marketingindsats for at afgøre, hvilke kampagner der virker for dig.
5 Brandsikring Metoder til strukturelle medlemmer (ikke kun stål)
Begræns ikke dig selv til spray brandsikring materialer. Disse er de bedste brandsikringsalternativer, der giver de samme fordele til en lavere pris.
Resultater og metoder til din 360 graders feedbackproces
De resultater, du oplever i din 360 feedbackproces afhænge af de mål, du ønsker at opnå. Medarbejderudvikling er det bedste resultat. Se mere.