DNA amplifikation gennem polymerase kædereaktion

PCR står for polymerasekædereaktion, en molekylærbiologi teknik til amplificering af segmenter af DNA ved at generere flere kopier ved anvendelse af DNA polymerase enzymer under kontrollerede betingelser. Så lidt som en enkelt kopi af et DNA-segment eller gen kan klones ind i millioner af kopier, hvilket gør det muligt at påvise farvestoffer og andre visualiseringsteknikker.

Udviklet i 1983 har processen med PCR gjort det muligt at udføre DNA-sekventering og identificere rækkefølgen af ​​nukleotider i individuelle gener.

Metoden bruger termisk cykling eller gentagen opvarmning og afkøling af reaktionen til DNA-smeltning og replikation. Når PCR fortsætter, anvendes det "nye" DNA som en skabelon til replikation og en kædereaktion følger, eksponentielt amplificerer DNA-skabelonen.

PCR-teknikker anvendes på mange områder inden for bioteknologi, herunder proteinteknik, kloning, retsmedicin (DNA fingerprinting), faderskabstest, diagnose af arvelige og / eller infektionssygdomme og til analyse af miljøprøver.

I retsmedicin er især PCR særlig nyttig, fordi det forstærker selv den mindste mængde DNA-bevis. PCR kan også bruges til at analysere DNA, der er tusindvis af år, og disse teknikker er blevet brugt til at identificere alt fra en 800.000-årig mammut til mumier fra hele verden.

PCR-proceduren er som følger:

• Initialisering: Dette trin er kun nødvendigt for DNA-polymeraser, der kræver hot-start PCR. Reaktionsblandingen opvarmes til mellem 94 og 96 ° C og holdes i 1-9 minutter.

• Denaturering: Hvis proceduren ikke kræver initialisering, er denaturering det første trin. Reaktionsblandingen opvarmes til 94-98 ° C i 20-30 sekunder. DNA-skabelonets hydrogenbindinger forstyrres, og enkeltstrengede DNA-molekyler skabes.
• Annealing: Reaktionstemperaturen er lavere til mellem 50 og 65 ° C og holdt i 20-40 sekunder. Primerne annealerer til den enkeltstrengede DNA-template. Temperaturen er ekstremt vigtig i løbet af dette trin. Hvis det er for varmt, kan primeren måske ikke binde. Hvis det er for koldt, kan primeren binde ufuldstændigt. En god binding dannes, når primer-sekvensen tæt svarer til skabelon-sekvensen.
• Forlængelse / forlængelse: Temperaturen under dette trin varierer afhængigt af typen af ​​polymerase. DNA-polymerasen syntetiserer en helt ny DNA-streng.
• Endelig forlængelse: Dette trin udføres ved 70-74 ° C i 5-15 minutter efter den endelige PCR-cyklus.
• Endelig hold: Dette trin er valgfrit. Temperaturen holdes ved 4-15 ° C og strejker reaktionen.

Proceduren er opdelt i tre faser:

• Eksponentiel amplifikation: I hver cyklus fordobles produkt (det specifikke stykke DNA, der bliver replikeret).
• Leveling-off-fase: Da DNA-polymerasen mister aktivitet og forbruger reagenser, sænker reaktionen.
• Plateau: Intet produkt akkumuleres.